Umumnya proses hidrogenasi minyak nabati menghasilkan asam lemak C18:1 sebagai produk utama, dan sebagian kecil asam lemak C18:2 atau asam lemak dengan ikatan rangkap terkonjugasi yang dapat diisolasi. Hidrogenasi minyak ikan menghasilkan trans-monoena dengan variasi panjang rantai karbon yang beragam, dan kemungkinan dalam jumlah yang signifikan. Kenyataan tersebut mengharuskan adanya suatu metode analisis yang dapat mendeteksi dan mengkuantisasi kandungan trans fatty acids dalam suatu produk olahan minyak. Metode analisis yang dapat digunakan untuk analisis minyak antara lain:
Spektroskopi Infra Merah
Spektroskopi Infra merah merupakan salah satu metode analisis yang dapat digunakan untuk determinasi ikatan rangkap trans, yang memberikan hasil lebih akurat bila ikatan rangkap trans tersebut diisolasi. Suatu ikatan rangkap trans yang terisolasi akan mengabsorbsi radiasi didaerah infra merah pada bilangan gelombang 967 cm-1 atau pada panjang gelombang 10,34 um, sebagai hasil deformasi ikatan C-H yang saling berdekatan. Ikatan rangkap trans dalam suatu sistem terkonjugasi akan menyerap radiasi pada bilangan gelombang yang lebih tinggi, seperti 983 cm-1 pada cis,trans-diena dan 994 cm-1 pada trans,trans,trans-triena.
Untuk keperluan determinasi ini, maka perlu disiapkan derivat metil ester dan scanning absorbansi pada pada daerah 900 sampai 1050 cm-1. Puncak trans dibandingkan dengan kurva kalibrasi larutan standar metil elaidat.
Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy lebih memungkinkan untuk determinasi ikatan rangkap trans dalam sampel minyak dan lemak. Metode ini lebih mudah dan akurat. Metode ini memungkinkan automatisasi penanganan sampel dan pengumpulan data. Metode spektroskopi FTIR digunakan terutama untuk analisis kandungan trans-monoena. Spektroskopi infra merah ini mengukur absorban ikatan rangkap trans pada bilangan gelombang 967 cm-1. Menurut standar yang ditetapkan oleh AOCS da IUPAC menggunakan prinsip ini, perbedaan signifikan hanya terjadi pada rentang panjang gelombang yang diseleksi untuk menggambarkan sebuah garis linier dimana area puncak akan diukur. Dalam kenyataannya, suatu sampel dengan kandungan trans nol akan tetap memberikan sebuah kurva garis dasar. Ini berarti bahwa rendahnya konsentrasi trans fatty acids suatu sampel akan memperbesar kesalahan. Dengan metode ini, hasil yang akurat akan diperoleh pada level trans monoena yang relatif rendah (kurang dari 2%).
Untuk analisis asam lemak tak jenuh majemuk trans dapat dilakukan dengan pengukuran ganda, yaitu dengan FTIR dan kromatografi gas.
Kromatografi
Metode kromatografi yang dapat digunakan untuk determinasi trans fatty acids, antara lain:
- Kromatografi Gas. Metode analisis ini menggunakan derivat metil ester yang dikemas atau kolom kapiler silika kering yang disalut fase diam yang sangat polar seperti SP-2340TM atau OV-275TM. Dengan kolom kapiler, tumpang tidih dua puncak yang sesuai untuk trans- dan kemudian cis-monoena yang terlihat pada tiap panjang rantai. Dalam metode ini harus dibedakan daerah dari masing-masing gugus. Metode kromatografi kolom kemas memberikan hasil yang lebih baik, karena daerah antara isomer cis- dan trans- lebih mudah diidentifikasi. Ratnayake et al telah menunjukkan bagaimana analisis pemisahan dengan spektroskopi infra merah dan kromatografi gas yang dikombinasi dengan suatu faktor koreksi untuk memperbaiki akurasinya, namun tetap masih menyisakan kesulitan-kesulitan. Dilain pihak telah dilakukan perbaikan metode yang telah ada untuk analisis asam lemak tak jenuh trans pada kromatografi gas kapiler, tetapi ini adalah teknik yang hanya dapat diterapkan oleh seorang analis yang telah ahli. Perubahan kecil pada kondisi kromatografi akan mempengaruhi waktu retensi relatifnya. Untuk analisis cis dan trans fatty acids dari suatu sampel minyak atau margarin, terlebih dahulu dilakukan derivatisasi menjadi ester-ester metil asam lemak (FAMEs). Derivatisasi ini dapat dilakukan dengan metode AOCS Official Ce 2-66. Mula-mula dilakukan transesterifikasi dengan suatu reagen seperti Meth-PrepTM 2 yang digunakan untuk mengkonversi trgiliserida dari minyak/margarin menjadi FAMEs. Pemisahan isomer cis dan trans dengan kromatografi gas yang dilakukan oleh Robert Wiedemer dari Grace Davison Discovery Sciences- Alltech Associates, Inc, menyatakan hasil terbaik bila menggunakan fae diam yang sangat polar dengan kandungan sianopril yang tinggi. Isomer cis mempunyai afinitas yang lebih kuat terhadap dipol siano daripada isomer trans, sehingga isomer trans akan terelusi sebelum isomer cis. Pemisahan ini dilakukan dengan kondisi: Kolom : Alltech Heifex ATTM SilarTM 100. Suhu oven 180 derajat celcius. Pembawa He dengan laju 1ml/menit, Detektor FID pada 250 derajat celcius, sampel margarin. Dari penelitian ini diperoleh suatu kromatogram yang menggambarkan bahwa dari satu sampel margarin yang dipisahkan puluhan jenis isomer geometrik dan posisional asam lemak jenuh, tak jenuh tunggal, dan tak jenuh majemuk. Dari percobaan tersebut dapat ditarik sebuah kesimpulan bahwa kromatografi gas kolom kapiler dengan fase diam mengandung sianopril tinggi efektif untuk pemisahan FAMEs jenuh dan tak jenuh.
- Kromatografi Ion Perak. Kromatografi lapi tipis dan High Performance Liquid Cromatografy (HPLC) sangat memungkinkan untuk pemisahan bentuk cis dan trans dari suatu isomer asam lemak tak jenuh tunggal. Masalah yang sering timbul adalah ketika sampel mengandung banyak isomer, tumpang tindih dua puncak dapat terjadi. Prinsip kerja teknik ini adalah proses adsorpsi, akibat masuknya perak nitrat kedalam matriks silika gel, yang menyebabkan terjadinya persenyawaan antara asam lemak dan silika dan antara ikatan rangkap dengan ion perak. Dalam teknik HPLC ion perak diikatkan kedalam suatu penukar ion, sehingga hanya interaksi antara ion perak dan ikatan rangkap yang teramati, sehingga dihasilkan resolusi yang lebih baik. Sistem kromatografi ini potensial untuk analisis yang komplit dan akurat dari trans fatty acids, terutama golongan monoena, dalam kombinasinya dengan prosedur-prosedur analisis lainnya. Namun, AOCS dan IUPAC menghindari penggunaan metode ini, karena telah diketahui bahwa kromatografi lapis tipis (KLT) tidak cocok untuk analisis multikomponen. Namun demikian HPLC ion perak lebih bersih, sederhana dan cepat sehingga lebih pantas untuk dipertimbangkan penggunaannya. Telah pula dikembangkan suatu metode analisis trans dengan KLT ion perak yang dikombinasi dengan analisis kromatografi gas dari suatu sampel sebelum dan sesudah pemisahan, dengan menggunakan komponen asam lemak jenuh sebagai standar internal. Sedangkan dalam HPLC ion perak, penggunaan kolom pendek ion perak, menghasilkan pemisahan derivat asam lemak jenuh, cis- dan trans monoenoat dalam waktu kurang dari sepuluh menit. Pengumpulan faksi terpisah dilakukan dengan kromatografi gas sebagai analisis kuantitatifnya. Richard Adolf dan koleganya telah mempublikasikan penggunaan HPLC ion perak yang memungkinkan resolusi posisional isomer-isomer cis dan trans fatty acids melalui penggantian fase gerak dan pengurangan ukuran sampel.
- Kromatografi Fase Balik. Tipe metode kromatografi lain yang memberikan hasil baik adalah dengan melibatkan reaksi kimia ikatan rangkap dengan formasi derivat yang tepat untuk analisis kromatografi gas. Metode paling sederhana dari tipe ini adalah dengan pembentukkan epoksida. Trans-epoksida dielusi melalui derivat cis-nya, sama seperti pada kromatografi kolom kemas, dan posisi ikatan rangkap dapat ditentukan. Masalahnya kemudian, isomer terkonjugasi tidak dapat diepoksida secara kuantitatif.
