Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikenal juga dengan istilah High Performance Liquid Chromatography (HPLC). KCKT merupakan perangkat peralatan yang penting dalam perkembangan dunia analisis bahan baku maupun bahan pencemar. Fungsi utama KCKT pada dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya ditentukan oleh ketinggian tekanannya, namun perkembangan teknologi telah menghasilkan produk kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak terlalu tinggi.
KCKT merupakan teknik pemisahan yang masih menjadi idola didunia analisis saat ini. KCKT digunakan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian berbagai sampel dalam berbagai bidang seperti farmasi, lingkungan, industri makanan dan minuman, industri polimer dan berbagai bahan baku. KCKT lebih banyak digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif), kecuali jika KCKT ini dihubungkan dengan sebuah spektrometri massa (Mass Spectrometer (MS)), maka penggunaannya akan lebih memungkinkan dalam analisis kuantitatif.
Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
- Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis
- Analisis ketidakmurnian (impurities)
- Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
- Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
- Isolasi dan pemurnian senyawa
- Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
- Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)
Komponen KCKT
Komponen utama dalam KCKT adalah juga komponen dalam kromatografi lainnya yaitu wadah/kemasan fase gerak, fase gerak, pompa KCKT, kolom, fase diam, detektor, dan perangkat komponen pendukung lainnya.
Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak dalam KCKT harus terbuat dari bahan yang bersih dan inert. Wadah ini dapat menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan terlebih dahulu harus dibebasgaskan. Kehadiran gas dalam wadah fase gerak ini akan menimbulkan gelembung gas pada pompa dan detektor yang akan sangat mengacaukan hasil analisis.
Fase Gerak
Fase gerak dalam KCKT harus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen dengan tingkat kemurnian yang sangat tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam fase gerak akan menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Partikel-partikel kecil yang terdapat dalam fase gerak yang kurang murni dapat mengakibatkan kekosongan kolom KCKT.
Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya merupakan campuran pelarut yang berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi dan resolusi KCKT ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat-sifat komponen dalam sampel.
Secara umum ada 2 tipe fase gerak:
- Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak berubah selama percobaan kromatografi
- Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut yang berubah selama masa kromatografi
Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat kita gunakan (pelarut/larutan) serta kemungkinan gradiennya akan menghasilkan kesempatan untuk mengoptimalkan pemisahan-pemisahan campuran kompleks dari segi resolusi maupun waktu. Secara normal elusi isokratik akan lebih mudah dikerjakan daripada elusi gradien.
Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan murni, namun pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak secara coba-coba tentu tidak mudah dilakukan.
Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak dibedakan menjadi:
- Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya akan meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak.
- Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya. Kemampuan elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya.
Deret eluotrofik yang merupakan deretan nama-nama pelarut yang disusun berdasarkan kepolarannya, akan sangat membantu kita dalam pemilihan fase gerak.
Dalam KCKT dengan fase terbalik, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran larutan buffer-metabol atau campuran air-asetonitril. Sedangkan dalam fase normal sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut terklorinasi atau menggunakan pelarut jenis-jenis alkohol.
Pompa
Pompa KCKT harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak. Bahan pompa dapat terbuat dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu nilam.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000 psi dan mamp mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk keperluan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe pompa:
- Pompa dengan tekanan konstan
- Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum digunakan.
Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Untuk mengetahui perbedaan kolom konvensional dan kolom mikrobor klik disini.
Dalam beberapa hal kolom mikrobor lebih menguntungkan, diantaranya:
- Kolom mikrobor mengkonsumsi fase gerak hanya 80% dari konsumsi kolom konvensional. Hal ini disebabkan karena kolom mikrobor mempunyai kecepatan alir yang lebih lambat (10-100 ul/menit)
- Aliran fase gerak pada mikrobor yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal untuk digabungkan dengan spektrometer massa
- Sensitivitas kolom mikrobor lebih tinggi karena pelarut yang lebih pekat, sehingga cocok digunakan dalam analisis sampel berskala kecil, seperti sampel klinis.
Perbedaan kolom konvensional dan mikrobor dapat anda lihat disini.
Fase Diam
Kebanyakn fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzena.
Daftar fase diam dapat dilihat disini.
Detektor
Detektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang bersifat universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif. Contoh detektor yang bersifat universal adalah detektor indeks bias dan spektrometri massa. Dan jenis detektor lainnya adalah detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan elektrokimia.
Detektor yang ideal akan mempunyai karakteristik berikut:
- Mempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksible
- Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang sangat kecil
- Stabil dalam pengoperasiannya
- Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul atau lebih kecil pada kolom mikrobar.
- Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran yang luas
- Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair ini. Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sensitivitas, jenis senyawa yang ada dalam sampel, dan faktor-faktor lain seperti biaya. Detektor yang paling umum didasarkan pada indeks bias dari eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni. Detektor ini mampu menginderai perbedaan tersebut dan menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang proporsional yang kemudian diperkuat dan direkam untuk menghasilkan kromatogram. Batasan utamanya adalah sensitivitas; batasan pendeteksian akan bervariasi sesuai dengan keadaan, yang umumnya sekitar satu mikrogram zat terlarut.
Detektor Spektrofotometri
Deteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam daerah ultraviolet. Idealnya, spektrofometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik.
Detektor fluorometri
Merupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens.
Detektor elektrokimia
Lazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana larutan tersebut mengalir diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada satu harga, dimana komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer elektron.
Perangkat Pendukung Lainnya
Perangkat pendukung lain yang digunakan dalam KCKT dapat berupa komputer, integrator dan rekorder.
