Radiasi elektromagnetik adalah energi yang merambat dalam bentuk gelombang. Sinar ultraviolet (UV) dan sinar tampak (visibel/vis) merupakan contoh radiasi elektromagnetik tersebut. Ada beberapa istilah yang terlebih dahulu harus diketahui sehubungan dengan radiasi elektromagnetik ini, diantaranya panjang gelombang, frekuensi dan energi. Panjang gelombang merupakan jarak linier dari suatu titik pada satu gelombang ke titik yang bersebelahan pada gelombang yang berdekatan. Dimensi panjang gelombang dapat dinyatakan dalam berbagai satuan panjang seperti sentimeter (cm), mikrometer (µm), nanometer (nm), dan angstrom (Å).
1 angstrom = 10-8 cm
1 nanometer = 10-7 cm
Satuan nm merupakan satuan yang paling sering digunakan untuk menyatakan panjang gelombang. Lambda (λ) merupakan simbol yang umum digunakan untuk menotasikan panjang gelombang. Sedangkan frekuensi merupakan banyaknya gelombang yang melewati suatu titik tertentu dalam satuan waktu.
Hubungan kuantitatif antara energi yang dimiliki oleh suatu radiasi elektromagnetik, frekuensi dan panjang gelombang dapat dituliskan dengan persamaan:
E = h.v.......................(1)
v = c/λ.......................(2)
Dari persamaan 1 dan 2 diatas dapat diperoleh persamaan
E = hc/λ
dimana:
E = energi radiasi
h = tetapan planck (6,626 x 10-34 joule)
c = kecepatan cahaya yang nilainya 2,998 x 1010 cms-1
λ = panjang gelombang
Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, sedangkan sinar tampak mempunyai penjang gelombang antara 400-750 nm.
Warna sinar tampak dapat dihubungkan dengan panjang gelombangnya. Sinar putih mengandung radiasi pada semua panjang gelombang di daerah sinar tampak. Radiasi monokromatik hanya akan menghasilkan satu sinar tampak.
Penyerapan Radiasi Oleh Molekul
Semua molekul mempunyai energi yang dapat digambarkan menjadi beberapa fenomena. Setiap molekul dapat bergerak:
- Gerak translasi, yaitu gerakan yang terjadi dimana suatu molekul bergerak secara keseluruhan. Energi yang berhubungan dengan gerak translasi disebut energi translasional (Etrans)
- Gerak vibrasi, yaitu gerakan dilakukan oleh sebagian dari molekul ( atom atau sekelompok atom). Energi yang berhubungan dengn gerak vibrasi disebut energi vibrasional (Evib)
- Molekul dapat berotasi pada sumbunya dan rotasi ini dikarakterisasi dengan energi rotasional (Erot )
- Suatu molekul juga memiliki konfigurasi elektronik yang besarnya energi elektronik (Eelek) ini tergantung pada keadaan elektronik molekul.
Energi suatu molekul merupakan hasil penjumlahan dari semua energi tersebut:
E = Etrans + Evib + Erot + Eelek
Komponen-komponen energi tersebut dapat dianggap memiliki nilai tertentu dan dikatakan terkuantisasi. Level energi suatu molekul berhubungan erat dengan struktur molekulnya. Hampir tidak 2 molekul yang memiliki energi vibrasional, rotasional dan elektronik yang identik.
Jika suatu molekul bergerak dari suatu tingkat energi ke tingkat energi yang lebih rendah maka beberapa energi akan dilepaskan. Energi tersebut dapat hilang sebagai radiasi dan dapat dikatakan telah terjadi emisi radiasi. Jika suatu molekul dikenai radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga energi molekul tersebut ditingkatkan ke tingkat energi yang lebih tinggi, maka terjadi peristiwa penyerapan (absorpsi) energi oleh molekul. Agar terjadi absorpsi, perbedaan energi antara dua tingkat energi harus setara dengan energi foton yang diserap, atau sesuai persamaan:
E2 - E1 = hv
dimana:
E1 = Energi pada tingkat yang lebih rendah
E2 = Energi pada tingkat yang lebih tinggi
v = frekuensi foton yang diabsorpsi
Banyaknya radiasi yang diserap oleh suatu molekul dapat diukur. Grafik yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi ( atau panjang gelombang) sinar disebut spektrum absorpsi (jamak; spektra). Transisi yang dibolehkan untuk suatu molekul dengan struktur kimia tertentu akan berbeda dari molekul lainnya, sehingga spektrum serapannya juga berbeda. Dengan demikian spektrum serapan molekul ini dapat dijadikan sebagai informasi analisis. Banyaknya sinar yang diabsorpsi sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi, sehingga spektrum absorpsi dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.
Kromofor merupakan semua gugus atau atom dlaam senyawa organik yang mampu menyearp sinar ultraviolet atau sinat tampak. Kromofor ini ditandai dengan adanya gugus alkena, alkun, karbonil, karboksil, amido, azo, nitro, nitroso dan nitrat. Selain adanya kromofor, pada molekul organik juga dikenal istilah auksokrom yang merupakan gugus fungsional yang mempunya pasangan elektron bebas/elektron menyendiri/elektron yang tak berikatan, seperti: -OH, -O, -NH2 dan lain-lain.
Aspek Kualitatif dan Kuantitatif Spektrofotometri UV-Vis
Spektrum serapan UV-vis dapat digunakan dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif.
Aspek Kualitatif
Data spektrum serapan UV-Vis tersendiri tidak dapat digunakan untuk keperluan identifikasi kualitatif suatu molekul obat maupun metabolitnya. Namun bila data tersebut digabungkan dengan metode lainnya seperti spektroskopi infra merah, resonansi magnetik inti, atau spektroskopi massa maka akan dapat digunakan untuk keperluan identifikasi senyawa. Data yang diperoleh dari spektrofotometri UV-Vis adalah:
- panjang gelombang serapan maksimum
- intensitas
- efek pH
- dan pelarut
dimana data tersebut dapat digunakan dalam analisis dengan membandingkannya dengan data literatur. Dari data spektrum dapat diketahui:
- Apakah serapan berubah atau tidak akibat adanya perubahan pH. Lebih lanjut jika perubahan terjadi apakah perubahannya bersifat batokromik, hipsokromik, hipokromik atau hiperkromik.
- Apakah molekul bersifat netral (misal; kafein, kloramfenikol) atau mengandung auksokrom (misal; amfetamin, siklizin)
Aspek Kuantitatif
Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu satuan luas penampang persatuan waktu. Hubungan kuantitatif spektrum serapan molekul dapat ditulis dengan persamaan:
A = abc
dimana:
A = absorban
a = absorptivitas
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
Persamaan diatas dikenal dengan hukum Lambert-Beer. Absorptivitas merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi, tebal kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Absorptivitas tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi.
Hukum Lambert-Beer berlaku jika:
- Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
- Penyerapan terjadi pada suatu volume yang mempunyai penampang luas yang sama
- Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap komponen lain dalam larutan tersebut
- Tidak terjadi fluoresensi atau fosforisasi
- Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan
Dalam analisis kuantitatif, spektrofotometri UV-Vis dapat digunakan dalam analisis zat tunggal (satu komponen) atau pun untuk analisis campuran 2 atau lebih zat (multi komponen).
Hal-hal yang Harus Diperhatikan dalam Analisis Spektrofotometri UV-Vis
Dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis dalam analisis, ada beberapa hal yang harus diperhatikan. Terutama bila analisis dilakukan terhadap zat-zat yang yang tak berwarna dan akan dianalisis dengan menggunakan spektrofotometri visibel, maka zat tersebut terlebih dahulu harus direaksikan menjadi zat yang berwarna.
Pembentukan Molekul yang Dapat Menyerap Sinar UV-Vis
Pengubahan suatu molekul menjadi molekul lain yang dapat menyerap didaerah UV atau visibel perlu dilakukan terutama bila molekul tersebut tidak menyerap didaerah UV atau visibel. Cara yang dapat digunakan untuk keperluan ini adalah mereaksikan molekul tersebut dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi persyaratan berikut:
Pembentukan Molekul yang Dapat Menyerap Sinar UV-Vis
Pengubahan suatu molekul menjadi molekul lain yang dapat menyerap didaerah UV atau visibel perlu dilakukan terutama bila molekul tersebut tidak menyerap didaerah UV atau visibel. Cara yang dapat digunakan untuk keperluan ini adalah mereaksikan molekul tersebut dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi persyaratan berikut:
- Reaksinya selektif dan sensitif
- Reaksinya cepat, kuantitatif dan reprodusibel
- Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama
Keselektifan suaru pereaksi dapat dinaikan dengan cara melakukan pengaturan pH, pemakaian masking agent, atau penggunaan teknik ekstraksi. Naftil etilen diamin (NED) adalah contoh pereaksi yang sering digunakan untuk mereaksikan obat-obat golongan sulfonamida melalui reaksi diazotasi menghasilkan suatu molekul yang berwarna sehingga dapat dianalisis dengan menggunakan spektrofotometri visibel.
Waktu Operasional
Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan.
Pada saat awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat sampai waktu tertentu hingga diperoleh absorbansi yang stabil. Semakin lama waktu pengukuran, maka ada kemungkinan senyawa berwarna tersebut menjadi rusak atau terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun. Karena alasan itulah maka pengukuran senyawa berwarna yang dihasilkan dari suatu reaksi harus dilakukan pada saat waktu operasional.
Pemilihan Panjang Gelombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang serapan maksimum. Panjang gelombang serapan maksimum ini dipilih karena:
- Pada panjang gelombang serapan maksimum, kepekaannya juga maksimum karena pada panjang gelombang tersebut perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar.
- Disekitar panjang gelombang serapan maksimum, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi
- Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang serapan maksimum.
Pembuatan Kurva Baku
Kurva baku dibuat dari pengukuran satu seri larutan baku zat yang akan dianalisis. Masing-masing larutan baku tersebut kemudian diukur absorbansinya, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan absorbansi (y) dengan konsentrasi (x). Hukum Lambert-Beer terpenuhi bila kurva berbentuk garis lurus.
Pembacaan Absorbansi Sampel
Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometri hendaknya berada pada kisaran 0,2 hingga 0,8 atau 15%-70% jika dibaca sebagai transmitan.
Sumber
Kimia Farmasi Analisis. Prof. Dr. Ibnu Gholib Gandjar, DEA., Apt; Abdul Rohim, M.Si., Apt.
