MOLECULAR DOCKING (PENAMBATAN MOLEKUL)

Docking atau penambatan molekul pada dasarnya adalah suatu pendekatan yang dapat digunakan untuk memodelkan interaksi antara molekul kecil dan protein target pada level atom yang memungkinkan kita mengkarakterisasi interaksi molekul kecil dengan protein target pada situs pengikatannya (binding site) serta menjelaskan proses biokimia yang terjadi. Pada dasarnya docking terjadi dalam 2 tahap, yaitu:

1. Prediksi konformasi serta posisi dan orientasi dalam situs pengikatan (atau disebut pose)
2. Penilaian afinitas ikatan

Mengetahui lokasi situs pengikatan sebelum proses docking akan meningkatkan efisiensi docking. Informasi tentang situs pengikatan dapat diperoleh dengan cara membandingkan protein target dengan family protein tersebut yang memiliki fungsi sama, atau dengan protein yang membentuk Kristal dengan ligand-ligand lainnya. Jika informasi tentang situs pengikatan tersebut tidak tersedia, maka program atau server online seperti: GRID, POCKET, SurfNet, PASS dan MMC dapat digunakan untuk membantu mengidentifikasi situs aktif atau situs pengikatan tersebut. Docking yang dilakukan tanpa memperhitungkan situs pengikatan disebut blind docking.(Slack, 1969)

Mekanisme pengikatan ligand-target, mula-mula diasumsikan menurut teori lock and key yang diperkenalkan oleh Fisher, dimana ligand tepat mengisi ruang pada target, seperti kunci yang tepat masuk ke dalam lubang gembok. Kemudian muncul teori induced fit yang diperkenalkan oleh Koshland yang kemudian menggantikan teori LOCK AND KEY tersebut. Menurut teori tersebut menyarankan bahwa ligand dan target harus dipandang sebagai molekul yang fleksibel selama proses docking, sehingga dapat menunjukan momen-momen pengikatan yang lebih akurat atau sesuai dengan kondisi real dalam tubuh.

TEORI TENTANG DOCKING

Pada dasarnya docking bertujuan untuk memprediksi struktur kompleks antara target-ligand dengan menggunakan metode komputasi. Tujuan docking tersebut dapat dicapai dengan 2 langkah yang saling terkait beriikut:

1.       Sampling konformasi-konformasi ligand pada situs aktif protein

2.       Merangking konformasi-konformasi tersebut melalui scoring function

Sampling Algorithms (Algoritma sampling)

Molekul protein dan ligand yang saling berinteraksi secara fleksibel akan menghasilkan banyak sekali mode-mode pengikatan diantara keduanya, sehingga akan memerlukan waktu komputasi yang lama dan biaya yang besar, maka dikembangkanlah berbagai algoritma sampling, yang diharapkan mampu mensampling mode-mode pengikatan yang refresentatif. Berbagai metode sampling tersebut dapat dilihat pada table 1.

Sumber : Meng (2012)

Tujuan dari fungsi skoring adalah menilai pose-pose yang benar-benar menggambarkan pengikatan antara senyawa yang aktif dalam waktu perhitungan yang wajar. Fungsi skoring dapat dibedakan menjadi:

1.       Force-field based scoring function, menilai energy pengikatan melalui perhitungan total energy non-ikatan (energy elektrostatik dan van der walls). Software docking seperti DOCK, GOLD, dan Autodock menggunakan fungsi skoring ini.

2.       Empirical based scoring function, dalam skoring ini dilakukan dekomposisi energy ikatan menjadi energy-energi penyusunnya, seperti energy ikatan hydrogen, interaksi ionic, efek hidrofobik dan entropi ikatan. Setiap komponen dikalikan dengan koefisiennya, kemudian dijumlahkan untuk menghasilkan energy total. LUDI, PLP dan ChemScore adalah contoh fungsi skoring yang diturunkan dari metode empiric ini.

3.       Knowledge based scoring function, menggunakan analisis statistic dari struktur Kristal kompleks ligand-protein untuk memperoleh frekuensi kontak antaratom dana tau jarak antara ligand an protein. Fungsi ini didasarkan pada asumsi bahwa interaksi yang disukai adalah interaksi dengan frekuensi yang lebih sering terjadi.

Table 2 menunjukan beberapa formula yang digunakan dalam scoring function.

Tabel 2 Contoh formula dalam fungsi skoring (Sumber: Meng (2012))

Skoring consensus adalah suatu strategi terbaru yang mengkombinasikan berbagai fungsi skoring yang berbeda untuk menilai konformasi docking. Contoh: CScrore menggabungkan fungsi skoring DOCK, ChemScore, PMF, GOLD, dan FlexX. 

Fungsi skoring tertentu nermasalah dalam hal prediksi afinitas terutama karena keterbatasannya dalam treatmen efek solvasi. Salah satu cara untuk mempebaiki kondisi tersebut adalah dengan scoring physics-based, seperti: MM-PB/SA (molecular mechanics-Poisson-Boltzman solvent-accesible surface area) dan MM-GB/SA (molecular mechanics Generalized Born/ solvent accessible surface area) yang melibatkan adanya rescoring atau optimisasi lead untuk memperbaiki akurasi prediksi afinitas ikatan. Kedua contoh metode tersebut telah menunjukan hasil yang baik.

METODOLOGI DOCKING

Ada beberapa metodologi yang biasa digunakan dalam docking:

1.     Rigid ligand and rigid receptor docking

Contoh aplikasi : DOCK, FLOG, TFDOCK (docking protein-protein.

2.       Flexible ligand and rigid receptor docking

Contoh program: Autodock, FlexX.

Autodock 3.0 memodelkan docking dengan ligand bersifat fleksibel, namun target tetap rigid. Sedangkan Autodock 4.0 mampu memodelkan fleksibilitas target, yang memungkinkan rantai samping target bergerak bebas.

FlexX menggunakan agoritma konstruksi tambahan pada konformasi ligand sampel. Fragmen dasar adalah yang terdocking pertama kali pada situs aktif mellau pencocokan pasangan ikatan hydrogen dan interaksi logam dan cincin aromatis antara ligand dan target. Fungsi skoring FlexX didasarkan pada Bohm’s work. Versi terbarunya memasukan sejumlah istilah seperti: interaksi elektrostatik, ikatan hydrogen direksional, entropi rotasional, interaksi hidrofobik dan aromatic.

3.       Flexible ligand and flexible receptor docking

Mobilitas intrinsic protein sangat mempengaruhi interaksinya dengan ligand. Saat ini telah bnayak tersedia berbagai metode yang memungkinkan docking dengan protein target yang fleksibel, sebagaimana dirangkum dalam Table 3.(Meng, Zhang, Mezei, & Cui, 2012)

Tabel 3. Metode docking dengan target yang fleksibel (Sumber: Meng (2012))

Gambar 1. Docking Ligand Flexible (Sumber: Meng (2012))

 PUSTAKA

Meng, X.-Y., Zhang, H.-X., Mezei, M., & Cui, M. (2012). Molecular Docking: A Powerful Approach for Structure-Based Drug Discovery. Current Computer Aided-Drug Design. https://doi.org/10.2174/157340911795677602

Slack, R. (1969). Medicinal chemistry and progress. Chemistry & Industry, 32, 1084–1085. https://doi.org/10.1002/0471266949

IDENTIFIKASI GUGUS FUNGSI ALKOHOL, FENOL DAN ETER

Gugus fungsi merupakan atom atau kelompok atom yang memberikan sifat fisiki dan kimia yang khas pada suatu senyawa. Ada berbegai macam gugus fungsi, diantaranya: alkohol, fenol, keton, aldehid, karboksilat, eter, ester, amina, nitroso, amida, nitro, guanidine, dan asam sulfnat. Gugus fungsi tersebut umumnya memiliki reaksi kimia yang khas dengan beberapa perekasi, sehingga dapat diidentifikasi berdasarkan reaksi kimianya tersebut.

Alkohol, fenol dan eter merupakan contoh senyawa yang sering digunakan dalam kehidupan sehari-hari.  Etanol sebagai salah satu contoh alkohol banyak digunakan sebagai pelarut, antiseptic dan kadang juga disalahgunakan sebagai minuman. Dietil eter, suatu contoh eter digunakan dalam anestesi (Fessenden).

Alkohol merupakan contoh senyawa organic yang memiliki gugus fungsi –OH (hidroksil) yang terikat pada atom C jenuh alifatik. Rumus umum alkohol adalah R-OH. Eter mempunyai rumus umum R-OR. Atom oksigen pada senyawa alkohol dan eter memberikan muatan parsial negative, karenanya alkohol dan eter bersifat polar. Alkohol lebih polar dibanding eter. Sifat fisika alkohol dan eter adalah:

                       1.          Titik didih, alkohol mampu membentuk ikatan hydrogen dengan molekul alkohol lainnya, sehingga alkohol memiliki titi didih yang lebih tinggi dibanding eter.

                       2.          Kelarutan dalam air, alkohol dapat membentuk ikatan hydrogen dengan air karenanya alkohol dapat larut dalam air, sedangkan eter tidak mampu membentuk ikatan hydrogen dengan air, maka eter tidak larut dalam air. Rantai hidrokarbon pada alkohol bersifat nonpolar, sehingga samakin panjang rantai hidrokarbon suatu alkohol maka kelarutannya dalam air semakin kecil. Sifat polar alkohol ditentukan oleh gugus –OH.

                       3.          Sebagai pelarut, alkohol dan eter merupakan pelarut untuk senyawa-senyawa organic, beberapa senyawa ionic juga dapat larut dalam alkohol. (Fessenden & Fessenden, n.d.)

Reaksi-reaksi penting dari Alkohol

                              1.            Reaksi esterifikasi

Alkohol akan mengalami reaksi esterifikasi dengan asam karboksilat membentuk senyawa ester dari asam karboksilat. Reaksi ini dapat berlangsung pada suasana asam.

                                              Gambar 1. Reaksi esterifikasi

                              2.            Ester organic dari alkohol

Senyawa ester anorganik dari alkohol adalah senyawa yang dihasilkan dari reaksi antara alkohol dengan asam-asam mineral seperti HNO₃ atau H₂SO₄ atau halide sam dari asam-asam mineral.

Contoh:

      Gambar 2. Reaksi pembentukan metil nitrat (contoh dari ester anorganik)

                              3.            Reaksi Oksidasi

Dalam kimia anorganik, oksidasi didefinisikan sebagai hilangnya sebuah electron dari suatu atom dan sebaliknya reduksi berarti diperolehnya sebuah electron oleh suatu atom. Namun, dalam kimia organic, menentukan apakah suatu atom karbon mendapat atau kehilangan electron tidak selalu mudah. Namun demikian reaksi oksidasi dan reduksi dalam kimia organic adalah sesuatu yang umum terjadi.

Alkohol dapat mengalami reaksi oksidasi dengan mendapatkan tambahan atom oksigen membentuk senyawa asam karboksilat. Dan sebaliknya asam karboksilat dapat kehilangan oksigen dan mendapat hydrogen membentuk alkohol. Alkohol dapat dioksidasi membentuk asam karboksilat, aldehide dan keton.

                Gambar 3. Reaksi oksidasi alkohol membentuk asam karboksilat

                Gambar 4. Reaksi reduksi asam karboksilat membentuk alkohol

Alkohol dapat direduksi menjadi alkana. Gugus fenol adalah gugus hidroksil yang terikat pada cincin aromatis.

RISIKO KANKER PADA PASIEN DERMATITIS ATOPIK

Sebuat studi observasional cohort dan case-control dari sumber data penelitian Medline dan Embase dari tahun 1946 hingga 1980, melaporkan bahwa pasien dermatitis atopik memiliki resiko terhadap kanker kulit dan nonkulit. Studi ini dilakukan dengan membandingkan insiden kanker kulit dan non-kulit pada pasien dermatitis atopik dan populasi umum yang tidak menderita dermatitis atopik.

Tinjauan sistematis dan meta-analisis ini melibatkan 8 studi cohort berbasis populasi dengan 5726692 partisipan dan 48 studi kasus terkontrol dengan 114136 partisipan. Pada studi Cohort ditemukan adanya hubungan statistik yang signifikan antara dermatitis atopik dengan beberapa tipe kanker bertikut:

1. kanker keratinosit 
2. kanker ginjal
3. kanker saraf pusat, dan
4. kanker pankreas

Dan dari studi kasus terkontrol diperoleh data, bahwa pasien dermatitis atopik memiliki resiko yang lebih rendah terhadapa kanker berikut:

1. kanker sistem saraf pusat
2. kanker pankreas
3. kanker paru-paru dan sistem pernafasam

yang bertentangan dengan hasil studi Cohort. 

Referensi:

Wang L, Bierbrier R, Drucker AM, Chan AW. Noncutaneous and Cutaneous Cancer Risk in Patients With Atopic Dermatitis. A Systematic Review and Meta-analysis . JAMA Dermatol. Published online December 11, 2019. doi:10.1001/jamadermatol.2019.3786

ELIMINASI KONTAMINAN LOGAM BERAT PADA ALIRAN SUNGAI

PENINGKATAN kegiatan industri telah terbukti meningkatkan kualitas dan kuantitas kontaminasi aliran air oleh logam-logam berat. Logam-logam seperti Ag, Pb, As, Be, Cd, Cr, Zn, Cu, Hg, Ni, Sb dan Tl, adalah logam-logam yang biasa hadir  dialiran sungai yang terkontaminasi limbah cair industri. Logam-logam tersebut dapat hadir dalam berbagai bentuk, sebagai unsur, ion atau pun bersenyawa dengan unsur-unsur lain. Jumlah logam dalam suatu lingkungan yang melebihi batas aman, beresiko langsung pada meningkatnya berbagai masalah kesehatan pada manusia dan hewan. Kondisi tersebut memaksa dilakukannya penanganan khusus untuk menurunkan kandungan cemaran logam berat tersebut.

Berbagai teknologi untuk memisahkan kontaminan tersebut pun telah dikembangkan. Teknik pengendapan merupakan teknik yang paling umum karena teknik ini dipandang murah, mudah dan efisien. teknik-teknik yang umum untuk menyingkirkan kontaminan logam berat diantaranya:

1. Pengendapan/Presipitasi. Logam yang terkandung diperairan dapat dipisahkan dari fase air melalui upaya pengendapan. Logam dapat diendapkan sebagai senyawa oksida/hidroksida, sulfida, karbonat atau pun fosfat. Presipitan yang selektif terhadap logam-logam tertentu juga telah banyak dikembangkan. Reaksi oksidasi-reduksi juga dapat menjadi upaya untuk mengendapkan logam spesifik seperti kromium (Cr) dan arsen (As). Teknik pengendapan dengan melibatkan aktivitas biologi dari mikroorganisme tertentu juga terbukti efektif untuk memisahkan logam dari lingkungan perairan. Selain itu, teknik pengendapan juga dapat dikombinasikan dengan teknik koagulasi-flokulasi.
2. Biopresipitasi. Biopresipitasi adalah teknik presipitasi yang melibatkan aktivitas biologi dari mikroorganisme tertentu untuk meningkakan efektivitas pengendapan logam. Teknik ini dapat berlangsung pasif atau dengan menggunakan reaktor biologis dari mikroorganisme yang mereduksi sulfat secara spesifik.
3. Adsorpsi. Adsorpsi merupakan upaya eliminasi logam-logam berat dari aliran air yang terkontaminasi dengan menggunakan material penjerap seperti karbon aktif, alumina aktif, chitosan, lignin, alginat, zeolit, tanah liat, gambut, wool, kapas atau pun oksida natural.
4. Biosorpsi. Biosorpsi adalah suatu teknik pengolahan limbah untuk menyingkirkan logam-logam beracun dengan memanfaatkan material organik sebagai biosorben. Material biosorben dapat berupa biomassa dari agro industri (lapisan luar buah atau sereal, kulit tanaman, sekam), biomassa kehutanan (kulit pohon, daun, serbuk gergaji), alga, bakteri, jamur, tanaman terestrial dan akuatik (fitofiltrasi/fitoakumulasi), lumpur limbah, ragi.
5. Pemisahan secara fisik, dapat dilakukan dengan cara : mikrofiltrasi, ultrafiltasi, nanofiltrasi, reverse osmosis, perforasi membran, kristalisasi beku, distilasi.
6. Pemisahan secara elektrokimia dengan elektrokoagulasi, elektrodeposisi, elektrodialisis, peroksidasi secara elektrokimia. 
7. Ekstraksi pelarut. Zat pengekstraksi yang dapat digunakan diantaranya: D2EHPA, hydroxyoximes, tri-n-octylammonium.
8. Flotasi atau pengapungan, yaitu cara pemisahan logam dari fase air dengan cara mengapungkan logam-logam tertentu dengan bantuan gelembung udara ke permukaan air.

Logam-logam berat yang mencemari lingkungan, umumnya akan memberikan dampak kesehatan tidak secara langsung, melainkan akibat proses absorpsi perlahan dan akumulasi dalam tubuh. Logam-logam berat tersebut diantaranya:

1. Antimon (Sb), biasanya hadir sebagai ion Sb(III) atau Sb(V). Sb(III) lebih toksik dari Sb(V). Toksisitas akibat logam ini dapat menyebabkan dermatitis, konjungtivitis, ulserasi nasal dan kemungkinan bersifat karsinogenik.
2. Arsen (As), arsen dapat berada dilingkungan dalam bentuk arsenit (As(III)) atau sebagai arsenat (As(V)). Keduanya sangat toksik. Presipitasi dalam bentuk As₂S₃ adalah teknik paling umum dalam pemisahannya. Rasa kering dan terbakar pada mulut dan kerongkongan, disfagia, mual, dermatosis, kram, edema pada wajah, abnormalitas jantung, kanker paru-paru, kulit, ginjal, liver, kerusakan pada saluran pernafasan, kardiovaskuler, saraf dan sistem hematopoeitik, serta kematian adalah toksisitas yang mungkin ditimbulkan oleh arsen.
3. Berilium (Be), umumnya hadir dilingkungan perairan sebagai kation divalen. Logam ini bersifat karsinogen. Be dapat menyebabkan penyakit paru-paru, beriliosis dan sitotoksisitas.
4. Kadmium (Cd), umumnya ditemukan dalam tingkat oksidasi +2. Cd dapat membentuk kompleks dengan berbagai anion seperti halida, nitrat, thiosulfat, ammonia dan sianida yang umumnya sangat tidak stabil. Garam-garam Cd memiliki kelarutan yang rendah dalam air. Toksisitas Cd dapat menyebabkan kerusakan ginjal, disfungsi dan nekrosis ginjal, edema pulmonar, penyakit Itai-itai, kanker paru-paru dan prostat.
5. Kromium (Cr), kromium dapat berada padatingkat oksidasi +2, +3 atau +6 dan dapat membentuk kompleks dengan berbagi kation dan anion lain. Tingkat oksidasi kromium dalam persenyawaannya umumnya sebagai trivalen (+3) atau heksavalen (+6). Kromium heksavalen sangat toksik. Cr(III) mudah diendapkan sebagai garam hidroksidanya. Sedangkan Cr(VI) tidak mudah mengendap, sehingga biasanya untuk mengeliminasi Cr(VI), terlebih dahulu dilakukan reaksi untuk mereduksi Cr(VI) menjadi Cr(III). Toksisitas Cr dapat menyebabkan iritasi kulit, sakit kepala, diare, mual, gagal ginjal, iritasi saluran nafas, emfisema, bronkhitis kronis, bronkopneumonia, kanker paru.
6. Tembaga (Cu), Ion Cu dapat berupa Cu(+) atau Cu(I) dan Cu(2+) atau Cu(II). Pengendapan Cu(I)-sulfida cukup efektif untuk mengeliminasi Cu. Cu divalen dapat membentuk kompleks dengan banyak substrat seperti amina, klorida dan oksalat. Toksisitas Cu dapat menyebabkan kelemahan, lethargi, anoreksia, nyeri abdomen, kram, nausea, diare, mual, sirosis hati, penyakit Wilson, kerusakan pada tubula ginjal, nekrosis hati.
7. Merkuri/raksa (Hg). Merkuri dapat berada pada tiga bentuk oksidasi yaitu: 0, +1 dan +2. Merkuri dan derivatnya bersifat toksik dan akumulasinya perlahan akan sangat membahayakan. Removal merkuri dapat dilakukan melalui pembentukan endapan dengan mereaksikannya dengan ligand yang mengandung sulfur. Natrium atau kalium dimetilkarbamat adalah agen pengendap yang sering digunakan untuk tujuan tersebut.
8. Selenium (Se), seperti halnya sulfur, selenium dapat berada pada empat tingkat oksidasi, yaitu: selenida (-2), selenium elemental (0), selenit (+4) dan selenat (+6).  Selenium paling umum dijumpai sebagai selenit. Senyawa logam selenida adalah senyawa yang stabil dan tak larut dalam air. Reduksi biologis dapat mereduksi selenit dan selenat menjadi unsur selenium yang memiliki kelarutan dan toksisitas lebih rendah. Selenit dapat dipisahkan dari larutan melalui pembentukan pengendapan dengan garam-garam ferri.
9. Thalium (Tl), memiliki tiga tingkat oksidasi yaitu: +1, +2 dan +3. Tingkat kelarutan Tl(III) sangat rendah pada kondisi pH lebih dari 3. Tl(I) sangat mudah larut. 
10. Seng (Zn). Zn umumnya ditemukan pada kondisi oksidasi +2. Logam ini sangat mudah ditemukan. Mudah larut pada daerah pH netral hingga asam. Zn dapat membentuk kompleks dengan amina, sianida, thiosianida, oksalat, etilendiamina, piridin, anilin dan hidrazin. 

Sumber:

Metals Precipitation from Effluents : Review

JENIS-JENIS BTP YANG DIIZINKAN DI INDONESIA

Bahan tambahan pangan atau BTP adalah bahan yang ditambahkan ke dalam pangan untuk mempengaruhi sifat atau bentuk pangan. 

BTP yang diizinkan digunakan di Indonesia diatur dengan Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan. Ada pun macam-macam BTP yang dapat digunakan adalah sebagai berikut:

ANTIOKSIDAN

Diatur dalam Perarturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan No. 38 Tahun 2013 tentang Batas Maksimum Penggunaan Bahan Tambahan Pangan Antioksidan. Antioksidan adalah bahan tambahan pangan untuk mencegah kerusakan pangan akibat oksidasi. Antioksidan yang diperbolehkan adalah:

1. Asam askorbat
2. Natrium askorbat
3. Kalsium askorbat
4. Kalium askorbat
5. Askorbil palmitat
6. Askorbil stearat
7. Tokoferol
8. Propil galat
9. Asam eritorbat
10. Natrium eritorbat
11. Butil hidrokinon tersier (TBHQ = tertiery butylhydroquinone)
12. Butil hidroksi anisol (BHA = butillated Hydroxyanisole)
13. Butil hidroksi toluen (BHT = butilated hydroxytoluene)

PENGAWET

Diatur dalam Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan No. 36 Tahun 2013 tentang Batas Maksimum Bahan Tambahan Pangan Pengawet. Pengawet (Preservative) adalah bahan tambahan pangan untuk mencegah atau menghambat fermentasi, pengasaman, penguraian dan perusakan lainnya terhadap pangan yang disebabkan oleh mikroorganisme. Pengawet yang diizinkan adalah sebagai berikut:

1. Asam sorbat dan garamnya
2. Asam benzoat dan garamnya
3. Etil parahidroksi benzoat (Ethyl Paraben)
4. Metil parahidroksi benzoat (Methyl paraben)
5. Sulfit
6. Nissin
7. Nitrit
8. Nitrat
9. Asam propionat dan garamnya
10. Lisozim Hidroklorida

PEWARNA

Diatur dalam Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan No.37 tahun 2013 tentang Batas Maksimum Bahan Tambahan Pangan Pewarna. Pewarna (Colour) adalah bahan tambahan pangan berupa pewarna alami atau sintesis, yang ketika ditambahkan atau diaplikasi pada pangan mampu memberi atau memperbaiki warna. Pewarna alami (Natural Food Colour) adalah pewarna yang diperoleh melalui ekstraksi, isolasi atau derivatisasi (sintetik parsial) dari tumbuhan, hewan, mineral atau sumber alami lain, termasuk pewarna identik alami. Pewarna sintetis adalah pewarna yang diperoleh melalui sintesis kimiawi. Pewarna yang diperbolehkan adalah sebagai berikut:

1. Pewarna Alami

• Kurkumin Cl No. 75300
• Riboflavin
• Karmin dan ekstrak cochineal CI. No. 75470
• Klorofil CI No. 75810
• Klorofil dan klorofilin tembaga kompleks CI No. 75810
• Karamel I (Caramel I-Plain)
• Karamel III amonia proses (Caramel III - ammonia process)
• Karamel IV amonia sulfit proses (Caramel IV - sulphite ammonia process)
• Karbon tanaman CI. 77266
• Beta karoten (sayuran) CI No. 75310
• Ekstrak anato CI No. 75120 (berbasis bixin)
• Karotenoid
• Merah bit 
• Antosianin
• Titanium dioksida CI No. 77891 

      2. Pewarna Sintetis

• Tartrazin CI No. 19140
• Kuning kuinolin CI No. 47005
• Kuning FCF CI No. 15985
• Kormoisin CI No. 14720
• Ponceau 4R CI No. 16255
• Eritrosin CI No. 45430
• Merah allura CI No. 16035
• Indigotin CI No. 73015
• Biru berlian FCF CI No. 42090
• Hijai FCF CI No. 42053
• Coklat HT CI No. 20285

PENGUAT RASA

Diatur dalam Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan No. 23 Tahun 2013 tentang Bahan Tambahan Pangan Penguat Rasa. Penguat rasa (flavour enhancer) adalah bahan tambahan pangan untuk memperkuat dan atau memodifikasi rasa dan atau aroma yang telah ada dalam bahan pangan tersebut tanpa memberikan rasa dan atau aroma tertentu. Penguat rasa yang diizinkan yaitu:

1. Asam L-glutamat dan garamnya
2. Asam guanilat dan garamnya
3. Asam inosinat dan garamnya
4. Garam-garam dar 5'-nukleotida

PENSTABIL

Diatur dalam Peratutan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan No. 24 tahun 2013 tentang Bahan Tambahan Pangan Penstabil. Penstabil adalah bahan tambahan pangan untuk menstabilkan sistem dispersi yang homogen pada pangan. Penstabil yang diizinkan yaitu:

1. Kalsium karbonat
2. Kalsium asetat
3. Asam fumarat
4. Lesitin
5. Natrium Laktat
6. Kalsium laktat
7. Natrium dihidrogen sitrat
8. Dinatrium monohidrogen sitrat
9. Trinatrium sitrat
10. Kalium dihidrogen sitrat
11. Trikalium sitrat
12. Mononatrium fosfat
13. Dinatrium fosfat
14. Trinatrium fosfat
15. Monokalium fosfat
16. Dikalium fosfat
17. Trikalium fosfat
18. Kalsium fosfat
19. Asam adipat
20. Asam alginat
21. Natrium alginat
22. Kalium alginat
23. Kalsium alginat
24. Propilen glikol alginat
25. Agar-agar
26. Karagen
27. Rumput laut euchema olahan
28. Gom kacang lokus
29. Gom guar
30. Gom tragakan
31. Gom arab
32. Gom xanthan
33. Gom karaya
34. Gom tara
35. Gom gelan
36. Gom Gatti
37. Gliserol
38. Gelatin
39. Pektin
40. Ester gliserol resin kayu
41. Dinatrium difosfat
42. Trinatrium difosfat
43. Tetranatrium difosfat
44. Tetrakalium difosfat
45. Dikalsium difosfat
46. Natrium tripolifosfat
47. Kalium tripolifosfat
48. Natrium polifosfat
49. Klaium polifosfat
50. Natrium kalsium polifosfat
51. Kalsium polifosfat
52. Alfa-siklodekstrin
53. Gama-siklodekstrin
54. Selulosa mikrokristalin
55. Selulosa bubuk
56. Metil selulosa
57. Hidroksipropil selulosa
58. Hidroksipropil metil selulosa
59. Etil metil selulosa
60. Natrium karboksimetil selulosa
61. Natrium kroskarmelos
62. Natrium karboksimetil selulosa hidrolisa enzim
63. Asam miristat, palmitat, stearat dan garam-garamnya (natrium, kalium, kalsium)
64. Garam-garam asam oleat (Natrium, kalium, kalsium)
65. Mono- dan digliserida asam lemak
66. Ester asam lemak dan asetat dari gliserol
67. Ester asam lemak dan laktat dari gliserol
68. Ester asam lemak dan sitrat dari gliserol
69. Ester asam lemak dan diasetiltartrat dari gliserol
70. Ester poligliserol asam risinoleat terinteresterifikasi
71. Natrium karbonat
72. Natrium hidrogen karbonat
73. Klaium karbonat
74. Kalium hidrogen karbonat
75. Amonium karbonat
76. Amonium hidrogen karbonat
77. Kalium klorida
78. Kalsium klorida
79. Kalsium sulfat
80. Kalium hidroksida
81. Kalsium hidroksida
82. Magnesium hidroksida
83. Malam
84. Papain
85. Bromelain
86. Polidekstrosa
87. Dekstrin
88. Pati modifikasi asam (Acid treated starch)
89. Pati modifikasi basa (Alkaline treated starch)
90. Pati pucat (bleached starch)
91. Pati oksidasi (Oxidizrd starch)
92. Pati modifikasi enzim
93. Monopati fosfat
94. Dipati fosfat
95. Fosfat dipati fosfat
96. Dipati fosfat terasetilasi
97. Pati asetat
98. Dipati adipat terasetilasi
99. Hidroksipropil pati
100. Hidroksipropil dipati fosfat
101. Pati natrium oktenilsuksinat
102. Asetil pati oksidasi
103. Natrium kaseinat

ANTIKEMPAL

Diatur dalam Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan No. 10 tahun 2013 tentang Bahan Tambahan Pangan Antikempal. Antikempal  (anticacking agents) adalah bahan tambahan pangan untuk mencegah mengempalnya produk pangan. Antikempal yang diizinkan yaitu:

1. Kalsium karbonat
2. Trikalsium fosfat
3. Selulosa mikrokiristalin
4. Selulosa bubuk
5. Asam miristat, stearat, palmitat dan garam-garamnya
6. Garam-garam dari asam oleat dengan kalsium, kalium dan natrium
7. Natrium karbonat
8. Magnesium karbonat
9. Magnesium oksida
10. Natrium besi II sianida
11. Kalium besi II sianida
12. Kalsium besi II sianida
13. Silikon doiksida halus
14. Kalsium silikat
15. Natrium alumonisilikat
16. Magnesium silikat

PENINGKAT VOLUME

Diatur dengan peratutan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan No. 25 tahun 2013 tentang Bahan Tambahan Pangan Peningkat Volume. Peningkat volume (bulking agents) adalah bahan tambahan pangan untuk meningkatkan volume pangan. Peningkat volume yang dizinkan adalah:

1. Natrium laktat
2. Asam alginat
3. Natrium alginat
4. Propilen glikoal alginat
5. Agar-agar
6. Karagen
7. Gom guar
8. Gom tragakan
9. Gom arab
10. Gom karaya
11. Ester gliserol resin kayu
12. Seulosa mikrokristalin
13. Selulosa bubuk
14. Metil selulosa
15. Etil selulosa
16. Hidroksipropil metil selulosa
17. Natrium karboksimetil selulosa
18. Mono- dan digliserida asam lemak
19. Kalsium sulfat
20. Polidekstrosa
21. Pati modifikasi asam
22. Pati modisfikasi basa
23. Pati pucat
24. Pati oksidasi
25. Monopati fosfat
26. Dipati fosfat
27. Fosfat dipati fosfat
28. Dipati fosfat terasetilasi
29. Dipati adipat terasetilasi
30. Hidroksipropil pati
31. Hidroksipropil dipati fosfat

PENGERAS

Diatur dalam Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan No.9 tahun 2013 tentang Bahan Tambahan Pangan Pengeras. Pengeras (Firming agents) adalah bahan tambahan pangan untuk memperkeras atau mempertahankan jaringan buah dan sayuran, atau berinteraksi dengan bahan pembentuk gel untuk memperkuat gel. Pengeras yang diizinkan yaitu:

1. Kalsium laktat
2. Trikalsium sitrat
3. Kalium klorida
4. Kalsium klorida
5. Kalsium sulfat
6. Kalsium glukonat

PENGENTAL

Diatur dalam Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan No. 15 tahun 2013 tentang Bahan Tambahan Pangan Pengental. Pengental (thickener) adalah bahan tambahan pangan untuk meningkatkan viskositas pangan. Pengental yang diizinkan:

1. Kalsium asetat
2. Natrium laktat
3. Kalsium laktat
4. Asam alginat
5. Natrium alginat
6. Kalium alginat
7. Kalsium alginat
8. Propilen glikol alginat
9. Agar-agar
10. Karagen
11. Rumput laut euchena olahan
12. Gom kacang lokus
13. Gom guar
14. Gom tragakan
15. Gom arab
16. Gom xanthan
17. Gom Tara
18. Gom Karaya
19. Gom Gelan
20. Gom gatty
21. Gliserol
22. Gelatin
23. Pektin
24. Ester gliserol resin kayu
25. Alfa-siklodekstrin
26. Gama-siklodekstrin
27. Selulosa mikrokristalin
28. Selulosa bubuk
29. Metil selulosa
30. Etil selulosa
31. Hidroksipropil selulosa
32. Hidroksiropil metil selulosa
33. Etil metil selulosa
34. Natrium karboksi metil selulosa
35. Natrium karboksimetil selulosa hidrolisa enzim
36. Mono- dan digliserida asam lemak
37. Klaium klorida\
38. Kalsium Klorida
39. Kalsium sulfat
40. Kalium hidroksida
41. Bromelain
42. Polidekstrosa
43. Deksrin
44. Pati modifikasi asam
45. Pati modifikasi basa
46. Pati pucat
47. Pati oksidasi
48. Pati modifikasi enzim
49. Monopati fosfat
50. Dipati fosfat
51. Foosfat dipati fosfat
52. Dipati fosfat terasetilasi
53. Pati asetat
54. Dipati asetat terasetilasi
55. Hidroksipropil pati
56. Hidroksipropil pati fosfat
57. Pati natrium oktenil suksinta
58. Asetil pati oksidasi
59. Natrium kaseinat

PENGEMULSI

Diatur dalam Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan No. 20 tahun 2013 tentang Bahan Tambahan Pangan Pengemulsi. Pengemulsi adalah bahan tambahan pangan untuk membantu terbentuknya campuran yang homogen dari 2 atau lebih fase yang tidak saling bercampur seperti minyak dan air. Pengemulsi yang diizinkan yaitu:

1. Kalsium karbonat
2. Lesitin
3. Natrium laktat
4. Kalsium laktat
5. Natrium dihidrogen sitrat
6. Dinatrium monohidrogen sitrat
7. Trinatrium sitrat
8. Kalium dihidrogen sitrat
9. Trikalium sitrat
10. Mononatrium fosfat
11. Dinatrium fosfat
12. Trinatrium fosfat
13. Monokalium fosfat
14. Dikalium fosfat
15. Trikalium fosfat
16. Asam alginat
17. Natrium alginat
18. Kalium alginat
19. Kalsium alginat
20. Propilen glikol alginat
21. Agar-agar
22. Karagen
23. Gom kacang lokus
24. Gom guar
25. Gom tragakan
26. Gom Arab
27. Gom karaya
28. Gliserol
29. Gelatin
30. Polisorbat
31. Pektin
32. Ester gliserol resin kayu
33. Dinatrium difosfat
34. Trinatrium difosfat
35. Tetranatrium difosfat
36. Tetrakalium difosfat
37. Kalium difosfat
38. Natrium polifosfat
39. Klaium polifosfat
40. Selulosa mikrokristalin
41. Selulosa bubuk
42. Metil selulosa
43. Hidroksipropil selulosa
44. Hidroksipropil metil selulosa
45. Etil metil selulosa
46. Natrium karboksimetil selulosa
47. Hidroksipropil metil selulosa
48. Etil metil selulosa
49. Natrium karboksimetil selulosa
50. Asam miristat, stearat dan palmitat serta garam-garamnya
51. Garam-garam asam oleat denga kalium, kalsium dan natrium
52. Mono- dan digliserida asam lemak
53. Ester asam lemak dan asetat dari gliserol
54. Ester asam lemak dan laktat dari gliserol
55. Ester asam lemak dan sitrat dari gliserol
56. Ester asam elmak dan diasetiltartrat dari gliserol
57. Ester sukrosa asam lemak
58. Ester poligliserol asam lemak
59. Ester poligliserol asam risinoleat terinteresterifikasi
60. Ester propilenglikol asam lemak
61. Natrium stearoil-laktilat
62. Ester sorbitan asam lemak

BAHAN TAMBAHAN PANGAN (FOOD ADDITIVE)

Pengertian dan Definisi

Menurut Permenkes No. 722 tahun 1988 Tentang Bahan Tambahan Makanan (BTM). BTM adalah bahan yang biasanya tidak digunakan sebagai makanan dan biasanya bukan merupakan ingredien khas makanan, mempunyai atau tidak mempunyai nilai gizi, yang secara sengaja ditambahkan ke dalam makanan untuk maksud teknologi (termasuk organoleptik) pada pembuatan, pengolahan, penyiapan, perlakuan, pengepakan, pengemasan, penyimpanan dan pengangkutan makanan untuk menghasilkan atau diharapkan menghasilkan (langsung atau tidak langsung) suatu komponen atau mempengaruhi sifat khas makanan tersebut.

Sedangkan menurut Permenkes No. 033 tahun 2012 tentang Bahan Tambahan Pangan (BTP). Bahan tambahan pangan yang selanjutnya disingkat BTP adalah bahan yang ditambahkan ke dalam pangan untuk mempengaruhi sifat atau bentuk pangan.

Prinsip-prinsip Penilaian Keamanan BTP Berdasarkan Pendekatan Analisis Risiko

Analisis risiko adalah suatu prosesyang terdiri dari: penilaian risiko, manajemen risiko dan komunikasi risiko. Risiko itu sendiri adalah suatu fungsi probabilitas dari suatu efek merugikan dan besaran efek tersebut akibat adanya bahaya dalam makanan. Contoh : Formaldehide murni berbentuk gas, sedangkan formaldehide dalam campuran dengan air disebut formalin. Formaldehide bersifat volatil, sehingga akan menguap dan membentuk udara jenuh dilingkungan, dan menyebabkan paparan melalui inhalasi. Paparan inhalasi berisiko karsinogenik. Paparan oral formaldehide tidak karsinogenik, namun berisiko toksik (TDI: 0,2 mg/Kg BB/hari.

Penilaian risiko (Risk Assesment) didasarkan pada ilmu pengetahuan (science based), Manajemen risiko berdasarkan kebijakan (Policy based), sedangkan komunikasi risiko berdasarkan pada kesepakatan semua pihak yang berkepentingan. Sebelum penetapan suatu aturan perlu dilakukan komunikasi semua pihak yang berkepentingan.

Penilaian Risiko
Penilaian isiko adalah evaluasi ilmiah terhadap efek yang telah diketahui atau berpotensi merugikan kesehatan manusia sebagai akibat paparan oleh bahaya yang terkait dengan makanan. Bukti ilmiah diperoleh melalui uji toksisitas dan uji epidemiologi. Uji toksisitas dilakukan pada hewan uji. Uji epidemiologi, contohnya pada warga Bamgladesh yang terpapar Arsen (As) dari lingkungan karena lingkungannya memiliki kandungan As yang tinggi, maka dilakukan uji epidemiologi untuk mengetahui batas paparan dari sumber lain yang masih mungkin tanpa menimbulkan gangguan.

Evaluasi dalam penilaian risiko meliputi:

1. Identifikasi Bahaya

Bahaya adalah sifat-sifat biologis, kimiawi maupun fisik suatu suatu substansi yang terdapat dalam makanan atau sifat-sifat makanan itu sendiri yang dapat menyebabkan efek merugikan kesehatan manusia (toksisitas). Sedangkan identifikasi bahaya adalah identifikasi efek yang telah diketahui atau berpotensi merugikan kesehatan manusia terkait dengan bahan tertentu (uji toksisitas).

Identifikasi bahaya dapat dilakukan dengan:

• Uji epidemiologi
• Uji toksisitas in vitro dan in vivo
• Hubungan kuantitatif struktur aktivitas (HKSA)
• Komputasi

Menurut dokumen WHO dalam International Programme On Chemical Safety, Priciples for The Safety Assesment of Food Additives an Contaminants in Food, WHO, Geneva, 1987 dalam subbab 3.1.2. Predicting toxicity from Chemical Structure, disebutkan:

"Chemical structure determines to a great extent the attitude of toxicologis towards a compound. As a result, there have been many efforts to systematize the use of chemical structures a predictor of toxicity. The use of such relationship hasbeen suggested by JECFA with certain classes of flavouering agents (section 6.1.2), and chemical structure is an important consideration in the selection of compounds for carcinogenicity testing. Structure/activity relationships also form the basis for establishing group ADI's (section 5.5.4). Structure/activity relationship appear to provide a reasonably good basis for predicting toxicity for some categories of compounds, primarily carsinogens, which are characterized by spesific fungtional groups (e.g nitrosamines, carbamates,, epoxides and aromatic amines) or by structural features an spesifik atomic arrangements (e.g polycyclic aromatic hydrocarbons and aflatoxins)".

Karakterisasi Bahaya

 Karakterisasi bahaya merupakan evaluasi kualitatif dan atau kuantitatif terhadap sifat efek merugikan suatu bahan biologis, kimiawi dan fisik yang mungkin terdapat dalam makanan. Parameter toksisitas, pernyataan karakter toksisitas secara kuantitatif dinyatakan dengan:

Non-Threshold Approach (Tanpa Ambang Batas)
Ini berarti pada setiap takaran terdapat risiko, maka yang harus dimenej adalah batas yang masih dapat ditoleransi. Pendekatan ini diterapkan untuk bahan-bahan yang merupakan kontaminan atau residu, bahan yang memiliki sifat genotoksik-karsinogenik dengan atau tanpa threshold. 

1. Prosedur ED10/LED10. Cara ini merupakan cara yang direkomendasikan oleh EPA. Dilakukan dengan menentukan margin of exposure (MOE). MOE dihitung sebagai rasio dari point of comparison (POC) yang dapat diturunkan dari kurva dosis-respon, dan perkiraan intake malalui makanan. MOE = POC/intake. Intreval kepercayaan dari insiden tumor pada 10% objek uji sebesar 95% (Lower 95% confidence of Benchmark Dose= BMDL = LED10 digunakan sebagai POC). Tabel MOE dapat dilihat pada tabel 1. Semakin besar MOE semakin baik, sebaliknya semakin kecil MOE maka semakin berbahaya. 
2. Prosedur T25. Pendekatan ini menghitung dosis relatif yang berhubungan dengan insiden tumor 25% dengan paparan suatu senyawa karsinogen seumur hidup melalui interpolasi tanpa memperhitungkan hubungan dosis-respon yang lengkap. Prosedur ini digunakan secara reguler jika kalkulasi benchmark tak dapat dibuat. Kelompok dosis terendah menunjukan insiden tumor yang meningkat secara signifikan dipilih sebagai poin of departure (POD). Dalam prosedur ini diperlukan: Background incidence (negative control), posisible correction of non lifespan experiment, assumption of complete absorption of the substance, Correction factor of dose (animal to human).

1. 

Pendekatan Nilai Ambang

Pendekatan ini digunakan untuk zat0zat yang non-karsinogenik genitoksik. Penentuan end point karakterisasi bahaya melalui:

• No Observed Effect Level (NOEL)
• No Observed Adverse Effect Level (NOAEL)
• Lowet Observed Adverse Effect Level (LOAEL)
• Dengan memperhitungkan faktor keamanan
• Menghitung Acceptable Daily Intake (ADI). ADI = (NOEL at NOAEL at LOAEL) / faktor kemanan
• Faktor keamanan nilainya 1-10000, namun yang biasa digunakan 100 untuk penggunaan jangka panjang atau 500 untuk penggunaan jangka pendek. FK 100 artinya 10 untuk variabilitas hewan-manusia, 10 untuk variabilitas antar manusia, maka faktor keamanannya = 10 x 10 = 100. FK pangan umumnya 100, namun bila data pengujian sangat meyakinkan maka FK bisa kurang dari 100.

 ADI adalah jumlah maksimum BTP dalam mg/Kg BB yang dapat dikonsumsi setiap harinya selama hidup tanpa menimbulkan efek merugikan terhadap kesehatan (mg/Kg BB/hr). ADI dapat dieproleh dari uji toksisitas pada hewan, perlu kehati-hatian dalam pemanfaatan data ADI untuk menghitung batasan penggunaan maksimum BTP.

Penilaian paparan adalah evaluasi kualitatif dan atau kuantitatif mengenai tingkat asupan yang dapat terjadi. Metode penilaian paparan dapat dilakukan dengan:

1. Perkiraan per kapita (pendapatan)
2. Perkiraan berdasarkan survey asupan makanan
3. Perkiraan berdasarkan survey "market-basket" (total diet)

Karakterisasi Risiko

Hasil yang diharapkan dari karakterisasi risiko adalah perkiraan kemungkinan efek merugikan terhadap kesehatan dalam populasi termasuk ketidakpastian yang menyertainya.

• Zat dengan nilai ambang dinilai berdasarkan ADI vs paparan, paparan yang kurang dari sama dengan TDI, maka dapat dinyatakan zero risk.
• Zat non nilai ambang, dinilai dengan data MOE, maka nilai MOE harus lebih dari sama dengan 10000 pada prosedur ED10/LED10, atau dosis setara T25 pada metode T25.

Manajemen risiko adalah proses dalam mempertimbangkan alternatif kebijakan untuk menerima, meminimalkan atau mengurangi risiko yang telah dinilai dan untuk memilih dan melaksanakan opsi yang sesuai. Manajemen risiko meliputi:

1. Evaluasi risiko; identifikasi bahaya, pmbentukan komisi penilaian risiko, dan pertimbangan hasil penilaian risiko.
2. Penilaian opsi manajemen risiko
3. Implementasi keputusan manajemen
4. Monitoring dan review

Komunikasi risiko adalah proses interaktif pertukaran informasi dan pendapat mengenai risiko diantara penilai risiko, menejer risiko, dan berbagai pihak terkait.

Materi kuliah Analisis Keamanan Pangan

IDENTIFIKASI FLAVONOID DENGAN MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETRI ULTRA VIOLET DAN VISIBEL

Sejumlah review mengenai penggunaan spektrofotometri ultra violet dan visible dalam identifikasi falvonoid telah banyak dipublikasikan sejak tahun 1962. Sebuah buku yang ditulis oleh Mabry et al (1970) menampilkan sebuah katalog detail dari spektrum ultraviolet 175 senyawa flavonoid dan dilengkapi dengan data reagent yang menginduksi geseran pada masing-masing flavonoid. 

Pertimbangan Umum

Spektrofotometri UV menjadi teknik utama dalam analisis flavonoid karena 2 alasan berikut:

1. Analisis hanya memerlukan sedikit senyawa murni. Seringkali bercak tunggal pada kromatografi kertas menghasilkan senyawa yang cukup untuk dianalisis dengan spektrofotometri UV.
2. Jumlah informasi yang berhubungan dengan struktur senyawa meningkat jika digunakan bersama reagent spesifik yang beraksi dengan gugus fungsi tertentu pada flavonoid. Penambahan secara terpisah masing-masing reagent pada suatu sampel yang mengandung flavonoid dengan pelarut alkohol akan menghasilkan geseran spektrum UV yang signifikan. Geseran-geseran tipe ini biasanya diinduksi oleh penambahan natrium metoksida (NaOMe), natrium asetat (NaOAc), natrium asetat-asam borat (NaOAc/H3BO3), alumunium klorida (AlCl3) dan alumunium klorida/asam hidroklorida (AlCl3/HCl).

Spektrum UV flavonoid umumnya terdiri dari 2 puncak serapan maksimum, pada rentang panjang gelombang 240-285 nm (pita II) dan pada 300-400 nm (pita I). Pita II terbentuk dari cincin benzoil A, sedangkan pita I dihasilkan dari cincin cinnamoil B.

Spektrum Flavonoid dalam Metanol

FLAVON DAN FLAVONOL

Flavon mengabsorpsi pada daerah 304-350 nm, sedangkan flavonol pada 352-385 nm, sehingga serapan pada pita I ini memberi petunjuk awal tentang tipe flavonoid yang diuji. Flavon dan flavonol dengan banyak atom oksigen akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih panjang dibanding dengan flavon dan flavonol yang memiliki atom oksigen lebih sedikit. Sebagai contoh:

• Gallangin (3,5,7-triOH) puncak absorpsi pita I pada 359 nm
• Kaemferol (3,5,7,4'-tetraOH), puncak pita I pada 367 nm
• Quersetin (3,5,7,3',4'-pentaOH) puncak pita I pada 370 nm
• Myristin (3,5,7,3',4',5'-hexaOH) puncak pita I pada 374 nm

Pita II kurang dipengaruhi oleh oksigenasi cincin B, meskipun 3',4'-dihydroxylated flavon umumnya menunjukan 2 puncak (atau satu puncak dengan bahu) pada daerah pita II. Pita II secara signifikan dipengaruhi oleh pola oksigenasi pada cincin A, dan panjang gelombang puncak meningkat dari 250 nm pada flavon menjadi 252 nm pada 7-hydroxyflavone, 268 nm pada 5-hydroxyflavone dan 5,7-dihydroxyflavone, 274 nm pada 5,6,7-trihydroxyflavone, serta 281 pada 5,7,8-trihydroxyflavone. Tak adanya gugus hidroksi pada kedua cincin biasanya dibuktikan dengan lemahnya intensitas pita yang relevan.

Metilasi atau glikosilasi pada atom 3,5- dan 4'-OH pada inti flavonoid menyebabkan geseran hipsokromik, khususnya pada pita I. Geseran tersebut sekitar 3-10 nm (pada pita I), menjadi 5-15 nm (pada pita I dan II) pada substitusi gugus 5-OH dan 12-17 nm pada substitusi 3-OH.


ISOFLAVON, FLAVANON, DAN DIHIDROFLAVONOL

Isoflavon, flavanon dan dihiroflavonol dikelompokkan manjadi satu karena kesamaan sifat dalam hal kurangnya konjugasi baik pada cincin A maupun B. Spektrum UV kelompok ini dapat dibedakan dari spektrum flavon dimana, intensitas absorpsi pita I lemah dan lebih menyerupai bahu bagi puncak pita II. Spektrum dari kelompok ini umumnya tidak dipengaruhi oleh pola oksigenasi dan substitusi pada cincin B. Namun, peningkatan oksigenasi pada cincin A menyebabkan geseran batokromik pada pita II, misal : 7,4'-dihydroxyisoflavone (249 nm), 5,7,4'-trihydroxyisoflavone (261 nm) dan 5,6,7,4'-tetrahydroxyisoflavone (270 nm).

Pada isoflavon, spektrum serapan pita II berada pada daerah 245-270 nm dan bahu pita I pada rentang 300-340 nm. 5-deoxyisoflavone (dan isoflavone 5-O-ethers) memiliki puncak pita II 7-17 nm lebih dekat dibanding 5-hydroxyisoflavone. Flavanon dan dihidroflavonol menunjukkan serapan maksimum pita II pada daerah 270-295 nm. Sebagai isoflavon, tidak adanya gugus 5-OH bebas menyebabkan geseran hipsokromik 10-15 nm.


KALKON DAN AURON

Kalkon dan auron dikarakterisasi oleh adanya spektrum pita I yang dominan dan pita II yang relatif minor. Pita II kalkon pada 220-270 nm sedangkan pita I pada 340-390 nm meski hanya sebuah pita minor atau infleksi sering terjadi pada daerah 300-320 nm. Sebagaimana flavonoid, peningkatan oksigenasi umumnya menyebabkan geseran batokromik terutama pada pita I.

Pita I auron umumnya ditemukan pada 370-430 nm. Contoh auron di alam: hispidol (388 nm), dan maritimetin (413 nm). Metilasi atau glikosilasi pada gugus OH pada inti auron tidak menyebabkan perubahan spektrum yang bermakna.


ANTOSIANIDIN DAN ANTOSIANIN

Spektrum antosianidin beserta glikosidanya, dan antosianin umumnya diukur dalam larutan metanol yang mengandung 0.01% HCl. Beberapa variasi lokasi serapan maksimum akan terjadi ketika pelarut yang digunakan etanol/HCl dan air/HCl yang saling menggantikan.

Antosianidin dan antosianin mempunyai serapan pita I pada rentang 465-550 nm, dan pita II menunjukkan puncak yang kurang intensif pada daerah 270-280 nm. Sebagaimana flavonoid laiinya, peningkatan oksigenasi pada cincin B menyebabkan geseran batokromik pita I, dibandingkan dengan pelargonidin (4'-OH) 520 nm, sianidin (3',4'-diOH) 553 nm, dan delphinidin (3',4',5'-triOH) 546 nm. Posisi pita I dapat juga menjadi panduan untuk menentukan substitusi pada cincin A, misalnya untuk membedakan 5,6,7-triOH antosianidin dari isomernya 5,7,8-triOH antosianidin , yang mengabsorpsi pada panjang gelombang 30 nm lebih pendek. 3-deoxyanthocyanidin memberikan puncak serapan pada pita I 40 nm lebih pendek dibanding 3-hydroxyanthocyanidin.

Metilasi dan glikosilasi pada gugus OH cincin A dan B antosianidin umumnya menyebabkan sedikit geseran hipsokromik. 3-glycosides dari pelargonidin, sianidin dan delphinidin masing-masing memiliki puncak pada 506, 525 dan 535 nm. Pola geseran batokromik dan intensitas absorpsi pada daerah 400-460 nm dapat digunakan untuk menentukan pola glikosilasi. Dimana Harborne menunjukkan bahwa 3,5-di- dan 5-glycoside hanya memiliki setengah absorpsi pada 440 nm,, yang relatif terhadap 3-glycosides.

Asilasi gula pada antosianin melalui substitusi  tipe asam sinamat ditunjukkan dengan adanya 2 puncak pada daerah UV, puncak tambahan (310-335 nm) disebabkan adanya gugus asil.

Geseran-geseran yang Diinduksi Natrium Metoksida

Semua gugus hidoksil (OH) dalam inti flavonoid akan terionisasi dalam beberapa tingkat tergantung pada kekuatan basa NaOMe. Karena pada umumnya flavonoid terhidroksilasi, geseran-geseran ke arah panjang gelombang yang lebih besar (batokromik) umumnya akan teramati pada kedua pita. Geseran-geseran yang terinduksi NaOMe diantaranya:

1. Pada Flavon dan Flavonol

• Adanya gugus 4'-OH dibuktikan dengan geseran batokromik pita I sebesar 40-65 nm, tanpa adanya penurunan intensitas
• Adanya gugus 3-OH pada flavonol tanpa 4'-OH juga menghasilkan geseran batokromik 50-60 nm, namun dengan adanya penurunan intensitas
• Glikosilasi pada gugus 7-OH sering terdeteksi dengan tidak adanya puncak absorpsi pada 320-330 nm yang umumnya akan teramati pada aglikon
• Flavonol yang mengandung gugus OH pada nomor  3,4'- dan 3,3',4' , akan memberikan spektrum pada kedua pita dengan intensitas menurn seiring waktu 

   2. Pada Isoflavon, Flavanon dan dihidroflavonol

• Tidak adanya geseran besar pada pita mengindikasikan tidak adanya hidroksilasi cincin A
• Adanya sistem 5,6,7- dan 5,7,8-triOH dibuktikan dengan adanya degenerasi spektrum MeOH-NaOMe seiring waktu. Hal ini juga dapat menjadi indikasi adanya sistem 3',4'-diOH pada isflavon dan dan flavanon.
•  Flavanon dan dihidroksiflavanol dengan sistem 5,7-diOH menunjukkan pergeseran batokromik yang konsisten sebesar 35-40 nm dalam NaOMe disertai dengan peningkatan intensitas puncak , Ketika gugus 5-OH tidak ada geseran sebesar 60 nm akan teramati.
• Beberapa flavanon, khususnya yang tidak memeiliki gugus 5-OH bebas, berisomerisasi membentuk kalkon dalam larutan alkali kemudian akan teramati puncak pita I pada daerah 400 nm.

    3. Pada Kalkon dan Auron

•  Gugus 4'-OH pada auron dan 4-OH pada kalkon dibuktikan dengan geseran batokromik sebesar 80-95 nm dan 60-100 nm, masing-masing, yang disertai dengan peningkatan intensitas
• 6-OH auron memberikan geseran yang lebih kecil (sekitar 60-70 nm) dibandingkan 4'-OH auron. Dan jika terdapat 6,4'-diOH atau 6-OH-4'-alkoksi terdapat dalam senyawa maka geserannya akan lebih kecil lagi.
• Kalkon yang tidak memiliki gugus 4-OH tapi memiliki 2- atau 4'-OH akan memberikan geseran batokromik pita I 60-100 nm, tanpa peningkatan intensitas
• Geseran yang berhubungan dengan gugus 4'-OH pada kalkon dikurangi 40-50 nm ketika ada gugus 2'-OH atau 4-alkoksi..

    4. Antosianidin dan Antosianin

•  Hanya antosianidin yang memberikan spektrum yang stabil dalam NaOMe, yaitu 3-deoxyanthocyanidins, geseran batokromik pita I sebesar 50-60 nm.

 Geseran-geseran yang Diinduksi Natium Asetat

Natrium asetat adalah basa yang lebih lemah dibandingkan NaOMe, karenanya hanya akan mengionisasi gugus OH fenolik yang lebih asam.

1. Flavon dan Flavonol

• Flavon dan flavonol yang mempunyai gugus 7-OH menunjukkan geseran batokromik 5-20 nm pada pita II. Adanya gugus 6- atau 8-oksigenais pada flavon (namun tidak pada flavonol) ditandai dengan penurunan tingkat geseran tersebut
• Perbandingan pada geseran pita I spektrum NaOMe dan NaOAc pada 4'-OH flavon dan flavonol dapat menunjukan dimana gugus 7-OH tersubstitusi atau tidak. Ketika tersubstitusi, pada NaOAc akan menghasilkan geseran yang sama atau lebih besar dibandingkan NaOMe.
• Adanya alkali mensensitisasi gugus seperti 5,5,7-, 5,7,8- dan 3,3',4'-triOH menyebabkan spektrum dalam NaOAc terdegenerasi seiring waktu 

    2.  Isoflavon, Flavanon dan Dihidroflavonol

• Adanya gugus 7-OH pada isoflavon dibuktikan dengan adanya geseran batokromik sebesar 6-20 nm. Dalam 5,7-diOH flavanon dan dihidroflavonol geserannya sebesar 35 nm, sedangkan 5-deoksi flavanon dan dihidroflavonol geserannya sebesar 60 nm
•  Alkali mensensitisasi gugus pada cincin A menyebabkan spektrum terdegenrasi seiring waktu.

   3. Kalkon dan Auron

• Gugus OH pada posisi 4' dan atau 4 pada kalkon dan pada 4' dan atau 6 pada auron dibuktikan dengan geseran batokromik pada pita I atau dengan munculnya puncak bahu.

Geseran yang Diinduksi Borat

Campuran NaOAc dan asam borat digunakan untuk mendeteksi gugus o-OH pada semua jenis flavonoid, namun tidak pada antosianin dan antosianidin. Geseran batokromik yang teramati adalah sebagai berikut:

1. Flavon dan flavonol (cincin B), 12-30 nm pada pita I. Gugus o-OH pada 6,7- dan 7,8- memberikan peningkatan ke arah geseran yang lebih rendah.
2. Isoflavon, flavanon, dan dihidroflavonol (hanya cincin A) 10-15 nm (pita II). Geseran ini tidak teramati pada gugus 5,6-diOH. 
3. Auron dan kalkon (cincin B) memberikan geseran 28-36 nm pada pita I. Gugus o-diOH memberikan peningkatan geseran yang lebih kecil.

Geseran yang Diinduksi Alumunium Klorida (AlCl3)

AlCl3 membentuk khelat dengan gugus fungsi seperti 5-hydroxy-4-keto, 3-hidroxy-4-keto dan ortho-hydroxy yang dibuktikan dengan adanya geseran batokromik pada salah satu atau kedua pita. 

1. Stabilitas relatif kompleks yang terbentuk adalah sebagai berikut: flavonol > 5-OH (flavon) > 5-OH (flavanon) > o-OH > 3-OH dihidroksiflavonol
2. Dengan adanya sejumlah kecil asam (HCl), kompleks akan terbentuk dengan gugus fungsi o-diOH dan 3-Hydroxy-4-keto dalam dekomposisi dihidroksiflavonol (gambar 1). Kompleks dihidroksiflavonol dapat dibedakan melalui instabilitasnya dalam NaOAc.
3. Jejak air dalam etanol (tapi tidak dalam metanol) mencegah pembentukan kompleks Al-o-diOH, karena itu metanol menjadi pelarut pilihan utama dalam mendeteksi gugus o-diOH.
4. Ketika sebuah gugus o-diOH ada dalam flavonoid bersamaan dengan 5- atau 3-OH, maka kompleks ganda akan terbentuk (gambar 1).
5. Ketika dalam flavonoid terdapat gugus 3- atau 5-OH maka pembentukan khelat 3-hydroxy-4-keto lebih disukai.

FLAVON DAN FLAVONOL

• Adanya gugus 5-OH dan tidak adanya 3-OH dibuktikan dengan geseran batokromik pita I sebesar 35-55 nm dalam penambahan GAlCl3/HCl.
• Flavon dengan 3- atau 3'- atau 5-OH akan menunjukan geseran batokromik pita I 50-60 nm dalam penambahan AlCl3/HCl. Reagent ZrOCl2/asam sitrat dapat digunakan untuk mendeteksi gugus 3-OH dengan adanya 5-OH.
• Adanya gugus o-diOH pada cincin B dibuktikan dengan adanya geseran batokromik dalam AlCl3 sebesar 30-40 nm dan teramati pada AlCl3/HCl. Kadang ketika AlCl3 segar digunakan dan senyawa mengandung 3',4'-o-diOH geseran pita I sebesar 10 nm kadang teramati diatas yag diperolah untuk AlCl3/HCl. Peningkatan geseran akan terjadi jika terdapat gugus o-diOH pada cincin A sebesar 20-25 nm. Jika gugus o-diOH hadir pada kedua cincin, maka nilai geseran merupakan penjumlahan keduanya.

ISOFLAVON, FLAVANON DAN DIHIDROFLAVONOL

• Adanya gugus 5-OH dibuktikan dengan adanya geseran batokromik 10-14 nm pada pita II isoflavon, dan 20-26 nm pada flavanon dan dihidroksiflavonol.
• Gugus o-diOH hanya akan terdeteksi pada cincin A (6,7 atau 7,8) dimana spektrum akan menunjukan geseran batokromik pita II 11-30 nm pada AlCl3, jauh diatas yang teramati pada AlCl3/HCl.
• Gugus 3-OH pada dihidroksiflavonol yang tidak memiliki gugus 5-OH bebas memberikan peningkatan geseran batokromik pita II sebesar 30-38 nm dalam AlCl3.

KALKON DAN AURON

• Adanya gugus 2'-OH pada kalkon dan 4-OH pada auron dibuktikan dengan geseran batokromik pita I 48-64 nm dan 60-70 nm, berturut-turut. Geseran kalkon akan berkurang sekitar 40 nm ketika terdapat oksigenasi pada posisi 3'.
• Gugus o-diOH pada cincin B akan memberikan peningkatan geseran batokromik40-70 nm pada pita I dalam AlCl3/HCl. Gugus o-diOH pada cincin A akan memberikan peningkatan geseran yang lebih kecil.

ANTOSIANIDIN DAN ANTOSIANIN

• Antosianidin dan antosianin yang mengandung gugus o-diOH akan memberikan geseran batokromik 25-35 nm pada PH 2-4 dengan AlCl3. Geseran yang lebih besar teramati pada 3-deoxyanthocyanidin. Efek penambahan gugus o-diOH akan memberikan efek aditif.

Dirangkum dari Buku The Flavonoids. Harborne J.B, T.J Mabry, H. Mabry. Chapman and Hall. London. 1975

Merupakan materi Kuliah pada mata kuliah Elusidasi Struktur

Sekolah Farmasi ITB

PENDEKATAN-PENDEKATAN DALAM SKRINING FITOKIMIA

Pentingnya bahan-bahan obat yang berasal dari tanaman dalam duni pengobatan modern sering dianggap remeh. Senyawa-senyawa seperti digitoksin, rutin, papain, amina, kuinin, papaverin, atropin, reserpin, ergometrin, ergonovin, kokain, vinkaleukoblastin, leurokristin, d-tubokurarin, proverin A dan B, efedrin, fisostigmin, pilokarpin, kafein, adalah sedikit contoh dari beragamnya aktivitas farmakologis yang dihasilkan dari senyawa-senyawa yang berasal dari alam. Terlebih lagi produk obat mentah seperti daun Digitalis purpurea dan akar Rowolfia serpentina sering digunakan secara langsung dalam praktek pengobatan.

Tujuan para ahli mengeksplorasi tanaman dalam dunia kesehatan adalah untuk mendapatkan isolat senyawa yang memiliki aktivitas biologi dan dapat digunakan dalam pengobatan. Karenanya, dengan pemilihan jenis tanaman yang spesifik untuk diinvestigasi lebih lanjut, kemudian diperlukan metode-metode pendekatan skrining fitokimia. Skrning fitokimia umumnya dimulai dengan melakukan uji terhadapnya ada/tidaknya kandungan alkaloid dalam sampel. Skrining dimulai dengan alkaloid karena alasan-alasan berikut:

1. Alkaloid umumnya memiliki aktivitas farmakologis tertentu, yang biasanya bekerja pada sistem saraf pusat, meski tidak selalu demikian
2. Mayoritas produk alam yang digunakan dalam pengobatan adalah senyawa golongan alkaloid
3. Uji kandungan alkaloid dalam sampel tanaman dapat dilakukan dengan metode yang sederhana dan cepat dengan hasil wajar terpercaya
4. Karena sifat kimianya, alkaloid dengan beberapa cara manipulasi relatif lebih mudah untuk diektraksi dan diisolasi.

Kelompok fitokimia lain seperti halnya flavonoid, umumnya tidak dipilih dalam skrining awal, karena kelompok senyawa ini memiliki diversitas dan aktivitas biologi yang sangat beragam. Sebagai contoh Willaman telah menemukan setidaknya 137 flavonoid alami yang terdapat pada 62 famili, 153 jenis, dan 277 spesies tanaman. Serta laporan adanya 33 akvitas biologi yang berbeda dari 30 jenis flavonoid. Contoh lain adalah Kumarin yang dilaporkan memiliki 31 jenis akvitas biologi yang berbeda.

Karena banyaknya jumlah kategori kimia senyawa alam, yang mungkin masing-masingnya memiliki aktivitas biologi yang berbeda, maka tulisan ini tidak dimaksudkan untuk mereviewnya. Tulisan ini akan fokus pada pembahasan untuk melakukan skrining fitokimia, yang dilanjutkan dengan pembahasan mengenai kategori-kategori fitokimia yang dihadirkan dalam tulisan ini. Kategori fitokimia yang dimaksud meliputi:

• alkaloid
• glikosida sebagai kelas umum (heterosida)
• saponin (steroid dan triterpenoid)
• sterol
• glikosida jantung
• antrakuinon
• flavonoid dan sejenisnya
• tanin
• kumarin dan senyawa yang berhubungan

Setiap metode yang digunakan dalam skrining fitokimia harus:

• simpel
• cepat
• desain dengan peralatan minimalis
• selektif untuk satu kelompok senyawa
• kuantitatif, memiliki batas deteksi yang rendah
• memberikan informasi tambahan mengenai ada atu tidaknya gugus spesifik dalam kelompok senyawa yang dianalisis

Prosedur skrining yang umumnya dipublikasikan memenuhi kriteria simpel, selektif, kuantitatif dan mampu memberikan informasi spesifik adanya gugus kimia tertentu dalam sampel, namun beberap diantara prosedur tersebut tidak reproduksible karena kurangnya detail dalam publikasi.

SKRINING ALKALOID

ALKALOID, Hegnauer mendefinisikan alkaloid adalah  senyawa yang agak atau kurang toksik yang terutama memberikan aktivitas biologis pada sistem saraf pusat, memiliki karakter basa, mengandung nitrogen herterosiklik, dan disintesis dalam tanaman dari asam-asam amino atau senyawa turunannya. Pada umumnya, distribusi alkaloid terbatas hanya pada kingdom plantae. Berdasarkan definisi ini, maka senyawa nitrogen alifatik (efedrin), amida (colchicine), dan asam-asam amino (tiamin) bukanlah alkaloid.

Diperkirakan distribusi alkaloid pada tanaman sekitar 15-20%, sumber lain menyebutkan sekitar 10%, 14%, atau bahkan 9-10%.

Alkaloid umumnya terdapat pada tanaman sebagai garam yang larut air, sehingga dapat diekstraksi dengan menggunakan air yang diasamkan, sehingga menghasilkan ekstrak mentah yang dapat secara langsung diuji dengan menggunakan reagent pengendap alkaloid. Namun, kekhawatiran akan hasil uji positif palsu, maka ekstrak mentah perlu dimurnikan terlebih dahulu sebelum akhirnya diuji. Pemurnian dilakukan dengan cara menambahkan basa dan kemudian dilakukan ekstraksi lanjutan dengan menggunakan pelarut air-pelarut organik. Ekstrak organik kemudian diuji dengan mengaplikasikan kertas saring, pengeringan dan dipping atau penyemprotan dengan reagent pendeteksi alkaloid. Jika metode ini tidak memuaskan, maka dapat dilakukan ekstraksi kembali ekstrak organik dengan menggunakan larutan asam dan penambahan reagent pengendap alkaloid.

Metode lain untuk menyingkirkan pengotor (misal: protein) pada ekstrak air-asam adalah dengan cara "salt out" dengan menambhakan bubuk NaCl. Sebuah prosedur tambahan pada deteksi alkaloid dapat dilakukan dengan penambahan alkali secara langsung pada serbuk sampel tanaman, kemudian dikestraksi dengan pelarut organik, kemudian di partisi dengan dengan cara diatas atau diuji alkaloid secara langsung.

Variabilitas hasil pada uji alkaloid dapat dipengaruhi oleh:

• usia tanaman
• iklim
• habitat
• bagian tanaman yang diuji
• musim
• waktu pemanenan
• sensitivitas tipe alkaloid pada reagent yang digunakan

contoh kasus:

• Geijera salicifolia memberikan konsistensi hasil pengujian yang lebih baik pada bentuk daun lebar dibandingkan dengan bentuk daun sempit, meskipun daun-daun uji tersebut tumbuh pada tanaman yang bersebelahan.
• Pada kelompok tanaman tertentu (misal: Compositae) alkaloid sering ditemukan hanya pada bunga atas, sedangkan pada Apocynaceae alkaloid umumnya berkonsentrasi pada akar dan kulit kayu.

Reagent Pendeteksi Alkaloid

Dalam skrining alkaloid terdapat 2 grup reagent yang biasa digunakan yaitu reagent pengendap alkaloid dan reagent semprot (spray and dip). Reagent pendeteksi alkaloid diantaranya:

• Mayer
• Silicotungsteic acid
• Dragendorff drop
• Wagner
• Dragendorff spay
• Sonnenschein
• Hager
• Bouchardat
• Phosphotungsteic acid
• Valser
• Chloroplatinis acid
• Sodium tetraphenylboron
• Ammonium reineckate
• Tannic acid

Sedangkan reagent pengendap alkaloid dapat dilihat pada tabel 1.

Setiap regaent memiliki sensitivitas yang beragam dan nospesifik, maka dalam skrining alkaloid biasanya digunakan 4 atau 5 reagent, dan hanya sampel yang memberikan memberikan hasil positif pada semua pengujian saja yang dipertimbangkan mengandung alkaloid. Reagent Mayer dan silicotungsteic acid adalah reagent yang banyak digunakan. Dalam uji sensitivitas reagent, disimpulkan bahwa tidak ada satu pun reagent yang mampu mendeteksi alkaloid (efedrin) pada konsentrasi 0.1% atau lebih rendah. Namun reagent Wagner, Bouchardat, Scheibler mampu mendeteksi alkaloid lain (selain efedrin) pada rentang konsentrasi 0.001-0.1%.

Metode lain yang dapat digunakan untuk mendeteksi alkaloid adalah dengan kromatografi.Regaent drop (spot) yang digunakan dalam kromatografi umumnya adalah hasil modifikasi dari reagent dragendorff drop, yang umumnya akan membentuk warna orange hingga merah dengan alkaloid. 

Beberapa reagent pendeteksi alkaloid memberikan reaksi dengan gugus tertentu atau gugus fungsi yang spesifik menghasilkan respon kromogenik karakteristik suatu alkaloid. Berikut adalah tabel yang memuat reagent-reagent umum dan spesifik terhadap alkaloid yang digunakan dalam kromatografi.

Reaksi Positif Palsu Alkaloid

Mekanisme reaksi antara alkaloid dan reagent pendeteksi tergantung pada karakter kimia alkaloid. Fulton mengklasifikasikan reagent pengendap alkaloid sebagai berikut:

1. Reagent yang berekasi dengan senyawa dasar alkaloid membentuk garam alkaloid yang tak larut, contoh: silicotungstic acid, phosphomolybdic acid dan phosphotungstic acid.
2. Reagent yang bereaksi dengan alkaloid sebagai senyawa kompleks longgar yang mengendap, contoh : reagent Wagner dan Bouchardat
3. Reagent yang bereaksi dengan alkaloid menghasilkan produk yang meningkatkan ketidaklarutan (menurunkan kelarutan) melalui nitrogen alkaloid, contoh: reagent Mayer, Valser, Marme dan Dragendorff
4. Reagent yang bereaksi melalui interaksi asam organik dengan basa alkaloid membentuk garam yang tak larut, contoh: reagent Hager.

Karena sifat-sifat reagent yang tidak spesifik maka sangat mungkin dihasilkan positif palsu pada pengujian alkaloid. Terlebih bila pengujian dilakukan langsung terhadap ekstrak yang tidak dipurifikasi dengan menggunakan pelarut asam-basa-organik.

Senyawa yang paling sering memberikan hasil positif palsu adalah protein. Protein akan membentuk endapan dengan adanya eagent yang mengandung logam berat. Protein-protein ini meliputi"albuminous substances seperti: pepton dan protamin. Selain itu, asam-asam amino juga umumnya memberikan positif palsu dengan reagent alkaloid umum. Glikosida tertentu, karbohidrat,, betain, kolin, purin, methylated amines, tanin dan garam-garam amonium juga mungkin memberikan positif palsu alkaloid.

Akhirnya, upaya pemisahan dengan melakukan ekstraksi dengan basa, diikuti dengan ekstraksi dengan pelarut organik dan kemudian diekstraksi kembali dengan asam-air akan mampu membantu meminimalisir hasil positif palsu. Sebuah laporan dari Briggs and Locker pada tahun 1940 sangat menarik, karena ia berhasil mengisolasi 3 senyawa dari Melicope lernata, yang membentuk endapan dengan reagent alkaloid dan membentuk kristal dengan penambahan asam, meskipun senyawa tersebut tidak mengandung nitrogen dan terbukti merupakan senyawa hidroksi flavon teralkilasi sempurna, yaitu senyawa meliternatin, meliternin dan ternatin.

Laporan terbaru dari Russian workers menunjukkan bahwa isolasi ala=kaloid yang bernama rosmaricine dari Rosmarinus officinalis (Labialae) menujukkan sesuatu yang anomali dari sejumlah alkaloid famili mint. Rosmaricine memang tidak muncul sebelum penambahan amonia (sebagaimana dilakukan oleh Russian worker dalam upaya isolasinya) dan alkaloid ini tidak pasti dibentuk sebagai hasil dari aksi dari basa pada carnosic acid. 

Reaksi alkaloid yang anomali juga ditunjukan ekstrak Samolus repens (Primulaceae) yang memberikan reaksi membentuk warna hitam dan mengendap dengan reagent Dragendorff. Fenomena ini sering terjadi pada pengujian bahan tanaman segar dan dapat diasumsikan sebagai reaksi dari salah satu iodin bebasndalam reagent dengan pati sehingga memberikan tipikal warna biru-hitam. Ekstrak dari Plagianthus divaritus (Malvaceae) memberikan warna pink, namun tidak mengendap dengan reagent Dragendorff.

Berikut contoh beberapa senyawa yang memberikan uji positif palsu alkaloid:

Reaksi Negatif Palsu pada Uji Alkaloid

Jika senyawa-senyawa basa nitrogen nonheterosiklik (protoalkaloid) dianggap sebagai alkaloid, maka kemungkinan besar kelompok senyawa ini akan memberikan hasil uji negatif jika diuji dengan reagent pengendap alkaloid. Selain itu, alkaloid kuarterner dan amina oksida (nupharidine, dilupine, trilupine) juga akan memberikan hasil uji negatif. Jika suatu ekstrak air-asam tanaman dipurifikasi dengan ditambah basa kemudian diekstraksi dengan pelarut organik, maka kedua lapisan ekstrak yang diperoleh (lapisan air dan pelarut organik) harus diuji alkaloid, dimana pada umumnya prosedur skrining alkaloid mengabaikan lapisan basa. Uji pada kedua apisan ekstrak dilakukan dengan asumsi bahwa alkaloid kuarterner dan amina oksida tidak dapat dipastikan keberadaannya, sehingga harus dikecualikan.

Materi ini merupakan materi kulaih pada mata kuliah Elusidasi Struktur

yang disampaikan Prof. Asep Ghana Suganda

Sekolah Farmasi ITB

Referensi:

Biological and Phytochemical Screening of Plants - Journal of Pharmaceutical Sciences

Maret 1966 volume 55, number 3